Nel 1780 il vescovo Alagona inaugurò il Museo del Seminario divenuto, nel 1808, Museo Civico presso l’Arcivescovado. Successivamente un decreto regio del 17 giugno 1878 sancì la nascita del Museo Archeologico Nazionale di Siracusa, inaugurato solo nel 1886 nella sua sede storica di piazza Duomo.
Dal 1895 al 1934 Paolo Orsi diresse il Museo, ma la successiva crescita dei reperti rese necessaria l’esigenza di un nuovo spazio presso l’attuale sede nel giardino di villa Landolina. Il nuovo spazio museale, affidato all’architetto F. Minissi, fu inaugurato nel gennaio del 1988 presso la Villa Landolina su due piani espositivi di 9.000 m2, di cui inizialmente solo uno dei piani fu aperto al pubblico, ed un seminterrato di 3.000 m2, dove è situato un auditorium. Nel 2006 è stato inaugurato l’ampliamento espositivo anche al piano superiore, dedicato al periodo classico e romano, restano tuttavia ancora da allestire i rimanenti spazi espositivi.
Il museo comprende reperti risalenti dai periodi della preistoria fino a quelli greco e romano provenienti da scavi della città e da altri siti della Sicilia.
Il piano terreno è diviso in 3 settori (A-B-C), mentre il corpo centrale (Area 1) è dedicato alla storia del Museo e vi sono presentati brevemente i materiali esposti nei singoli settori.
Settore A
Il settore A, dedicato alla preistoria (Paleolitico superiore-Età del ferro), con un’esposizione di rocce e fossili che testimoniano le varie forme di animale nel Quaternario. Essa è preceduta da una sezione in cui vengono mostrate le caratteristiche geologiche del Mediterraneo e della zona Iblea.
Settore B
Nel settore B, dedicato alle colonie greche della Sicilia del periodo ionico e dorico, è possibile identificare l’ubicazione delle colonie greche in Sicilia e le rispettive città di provenienza. Sono inoltre esposte: una statua marmorea di Kouros acefala proveniente da Leontinoi (Lentini) datata agli inizi del V secolo a.C. I reperti della colonia dorica di Megara Hyblaea, statuette votive di Demetra e Kore e una Gorgone, una testa di Augusto proveniente da Centuripe. Inoltre è esposta anche la Venere Anadiomene detta anche Venere Landolina dall’archeologo che la scoprì a Siracusa nel 1804, definita stupenda “per l’eccellenza del modellato, lo squisito trattamento del nudo, di incredibile vivezza e morbidità”[senza fonte] dal Bernabò Brea.
Settore C
Nel settore C sono esposti reperti delle sub-colonie di Siracusa: Akrai (664 a.C.), Kasmenai (644 a.C.), Camarina (598 a.C.), Eloro. Nonché reperti provenienti da altri centri della Sicilia orientale e da Gela ed Agrigento.
Settore D
Il settore D, posto al primo piano, è stato inaugurato nel 2006 e contiene i reperti di epoca ellenistico-romana. Al suo interno sono contenuti alcuni tra i reperti più celebri del museo: la Venere Landolina ed il Sarcofago di Adelfia, oltre ad una selezione di monete provenienti dal gabinetto numismatico di piazza Duomo.